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撰稿
课题组供稿
01导读克日，南京理工大学电子工程与光电手艺学院智能祈望成像尝试室（SmartComputationalImagingLaboratory,SCILab）的协商团队在国际顶级光学期刊《Light:ScienceApplications》上颁发了题为：“Transportofintensitydiffractiontomographywithnon-interferometricsyntheticapertureforthree-dimensionallabel-freemicroscopy”的协商论文。南京理工大学博士后李加基为本文的第一做家，左超教给与陈钱熏陶为论文的协同通信做家，南京理工大学为论文的唯独通信单位。
协商团队所提议的非干预合成孔径光强传输衍射层析手艺（Transportofintensitydiffractiontomographywithnon-interferometricsyntheticaperture,TIDT-NSA）是一种新式三维无标识显微成像手艺。该项做事推导出了针对二维定量相位与三维衍射层析成像的普适通报函数表白式，并初次将光学通报函数理论与基于Kramers-Kronig的定量相位成像理论统一到了统一个理论框架中。基于此理论框架，提议了基于“三维光强传输”的非干预合成孔径的光学衍射层析办法，攻破了保守基于非对称照明的二维定量相位成像与衍射层析手艺中的“般配照明”，即照明数值孔径须要老成般配于物镜数值孔径，这一束缚性前提的依赖。该办法有机地贯串了基于轴向离焦的光强传输与基于多角度照明合成孔径的思惟，不只将三维衍射层析的成像分辩率拓展至非联络衍射极限，还维持了对繁杂厚样本的高衬度、抗散射、高轴向层析的成像才力。文章经过量组仿真与生物样本尝试，囊括人类乳腺癌细胞（MCF-7）、人类肝细胞癌细胞（HepG2）、小鼠巨噬细胞（RAW.7）和奇丽隐杆线虫（C.elegans），展现了TIDT-NSA可实行横向分辩率为nm，轴向分辩率为nm的高原料无标识三维层析成像，并对种种繁杂样本具备优越的合用性。对海拉细胞（HeLa）动态三维无标识成像的成效也展现了TIDT-NSA在活细胞动态成像方面的普遍运用前程。
02协商布景荧鲜明微成像1,2是一种依赖于外源性荧光试剂的成像手艺，经过荧光染色等化学染色办法，可觉得弱吸取性（通明）生物样本供应高比较度成像；泽尼克相衬显微术（Zernikephasecontrast,ZPC）和微分干预相衬显微术（Differentialinterferencecontrast,DIC）则行使相位散布来形成强度图象衬度，这一类办法将相位差或相位梯度更动为强度比较，进而大地面抬高了通明物体在光学显微镜下的可分辩性，如图1所示。而定量相位成像手艺（Quantitativephaseimaging,QPI)3能够定量地反响待测样本沿轴向的光程差推迟，而且能够量化细胞布局布局的某些要害的物理特征，在生物医学成像及性命科学等周围得到了普遍的运用。
图1生物医学中标识成像与无标识成像办法的比较。荧光染色等侵占式办法会带来光漂白等题目，泽尼克相衬、微分干预相衬及定量相位成像等无标识办法能够实行无标识高衬度成像
差别于二维定量相位散布，每每更多地采取复折射率（ComplexRefractiveindex），即空间介电常数来表征物体的三维光学属性散布。图2展现了未染色细胞样本的定量相位成效与三维折射率成效比较，行使定量相位成像手艺复原得到的相位成效本质上是待测样本三维折射率散布沿笔直于二维平面上的轴向投影消息（2.5D成像），并非物体内部可靠的三维消息散布，且不具备轴向分辩才力。而行使衍射层析显微成像手艺所复原出来的是样本在三维体空间中的不同轴向地位的折射率消息散布（3D成像），具备轴向分辩与层析才力。因而，做为一种新式的三维显微成像用具——衍射层析显微成像手艺的进展与运用成为了必定的趋向。
图2二维定量相位成像和三维折射率衍射层析成像成效比较
光学衍射层析（Opticaldiffractiontomography,ODT）将数字全息显微镜（Digitalholographicmicroscope,DHM）与祈望层析扫描手艺（Computedtomography,CT）相贯串，将样本相位消息从干预条纹图象中解调出来，经过扭转振镜来改革照明方位或扭转位移台来扭转物体等方法来获得待测三维物体在不同角度下的定量相位消息散布；尔后贯串滤波反投影算法（疏忽衍射效应）4或许E.Wolf衍射层析理论（思考衍射效应）5，便可重修出物体的空间三维折射率散布。连年来，光强衍射层析显微术（Intensitydiffractiontomography,IDT）6,7做为一类基于非干预强度丈量旨趣的三维衍射层析手艺慢慢出现头角，它将“复原相位手艺”与“三维折射率重修办法”两者有机贯串，摆脱了对于全息干预丈量的须要，由强度图象直接反表演物体的三维折射率散布。
图3展现了在生物医学诊断中罕见的X射线断层扫描与光学衍射层析手艺的旨趣类比，并讲解了基于干预和非干预丈量办法的衍射层析成像的不同实行方法。个中，最具代表性的手艺为光强传输衍射层析显微成像（Transportofintensitydiffractiontomography,TIDT）8与傅里叶叠层衍射层析显微成像（Fourierptychographicdiffractiontomography,FPDT）9,10。总而言之，光强衍射层析实质上是受光强传输方程所启示，将透过三维物体的一系列轴向光强散布与该物体三维折射率散布联络起来，再行使联络通报函数理论便可重构出待测样本的三维折射率散布消息。
图3祈望层析成像与衍射层析成像手艺比较，以及基于干预丈量办法和强度丈量办法衍射层析成像的不同实行方法
03改革协商光学通报函数与般配照明前提
自E.Wolf提议傅里叶衍射定理以后，多年以来保守基于干预办法的光学衍射层析手艺的旨趣就没有产生变动，行使干预全息图来获得不同照明角度下的相位散布，尔后将得到二维傅里叶频谱填充至三维频谱空间中；行使联络合成孔径以及二维相位复原的思惟，便可实行基于联络照明下干预办法的光学衍射层析成像。但照明光源的联络性被拓展时，由联络光到部份联络乃至好坏联络照明，保守干预成像慢慢迈向非干预成像，个中榜样的非干预相位成像手艺有光强传输方程（Transportofintensityequation,TIE）11、差分相衬成像（Differentialphasecontrast,DPC）12,13和傅里叶叠层成像（Fourierptychographicmicroscopy,FPM）14–17等；当入射光产生歪斜时，成像系统的光学通报函数会产生调制，咱们更多地是经过其通报函数举行解读，并经过相位反演算法复原出物体的定量相位散布。
比拟于保守干预丈量办法，非干预定量相位成像挣脱了激光以及干预安设的束缚，兼容部份联络光源和明场成像光路，对于成像过程的履行越发交情。但是，对于以FPM和DPC这一类经过歪斜照明来调控通报函数的榜样代表办法来讲，其重构过程中存在着低频缺失的题目；当照明情形生气足般配照明时（照明数值孔径小于物镜数值孔径），二维通报函数在低频处互相对消，致使低频处频谱成份缺失。而环形照明孔径能够使照明般配前提知足，低频缺失题目得到缓和，基于此照明情形下的定量相位复原和三维折射衍射层析重构也能够获得较好的成像成效；本协商团队在以前的做事中提议了一系列基于环形照明孔径的定量相位成像11以及强度衍射层析成像手艺7,8充足讲解了般配照明前提对于定量相位成像的要害性。
光学通报函数理论与Kramers-Kronig联络的统一化框架
迩来，来自韩国科学手艺院（KAIST）的Y.Park熏陶团队将Kramers-Kronig联络引入到定量相位成像周围18，并基于此来解读非对称照明下的相位复原题目。Kramers-Kronig联络（简称KK联络）是希尔伯特变幻的一个通例，其形貌了具备因果性的平方可积函数实部与虚部之间的数学联络，即能够经过强度（实部）丈量中揣摸出相位份量（虚部）。而Titschmarch定理则将函数傅里叶变幻域半平面的因果性与其空间域分化性联络了起来。但是，KK联络所依赖的物函数半平面分化特征请求记号在傅里叶域仅占有半平面，这须要照明数值孔径老成般配于物镜数值孔径。这也即是本文出处所提到的“般配照明前提”，该前提在高数值孔径的成像系统中（譬喻操纵油浸物镜时）每每难以知足，成为该项手艺运用于高分辩衍射层析成像的一大关键妨碍。另外KK联络理论当前仅限定于二维相位成像，由二维相位成像向三维衍射层析的拓展仍旧容易借助于保守E.Wolf的全息ODT思惟，亟待进一步进展与完美。特殊值得一提的是，光学通报函数理论迩来已被普遍运用在定量相位成像与衍射层析成像中，用于定量分化与优化成像系统对相位物体的成像分辩率与信噪比。而早在，本文做家团队就揭发了般配物镜数值孔径的环形照明对提高光强传输方程相位成像的分辩率与离焦衬度19–21，以及对傅里叶叠层显微成像中的低频相位灵验重修的要害意义。基于此，协商团队前后提议了基于环形照明的傅里叶叠层显微成像手艺（Annular-illuminationbasedFourierptychographicmicroscopy,AIFPM）22和单帧傅里叶叠层显微成像手艺（Single-shotFourierptychographicmicroscopy,SFPM）23：协商人员发觉“般配照明前提”下的相位通报函数恰巧是频域中对于原点对称且在原点处相切的两个圆形光瞳（如图4（d）所示），如此两个光瞳之间没有互相堆叠、互相对消的部份，保证了相位通报函数能够遮蔽一共低频成份，其焦点思惟与要紧论断与Y.Park熏陶团队所提议的KK联络不约而同。
在本协商做事中，南京理工大学的协商团队在前期做事的根本上欣喜地发觉KK联络中所请求的分化特征在三维空间中的随意照明角度能够得到知足，进而攻破了对于般配照明前提的老成束缚，且初次将KK联络从二维拓展到三维；另外，将函数因果性和半频域平面分化性等价联络相联络，树立了KK联络下物函数分化特征与光学通报函数的统一化理论框架，经过三维通报函数理论和三维KK联络的互相统一解读了单色联络光照明下光场频谱散布联络；行使三维通报函数理论能够使三维KK联络在职意照明前提下得到完美的知足，行使联络照明下的轴向扫描，揭发了经过三维光强传输衍射层析办法能够灵验防止般配照明前提致使的低频缺失题目。
图4（a-c）展现了歪斜照明光对于二维和三维通报函数的调制效用，并行使合成孔径思惟，抵达全频谱遮蔽的方针。而图4（d）和（e）则展现了在职意照明和般配照明前提下二维及三维相位通报函数散布，当照明孔径为环形般配照明时，通报函数中的两个光瞳全面分别，此时KK联络中物函数的半平面分化特征得到知足，进而能够求解出相位消息；在职意照明角度下，二维通报函数的幅值相应在低频互相对消，致使终究在低频处的频谱成份缺失。而三维通报函数的频谱散布在职意照明角度下三维空间中不停是可分别的，即等价三维KK联络中半空间可分化性前提知足，进而攻破了般配照明前提的老成束缚。在二维定量相位成像中，为了保证般配照明前提的知足，即相位通报函数中两个光瞳在低频处全面相切、不互相对消，基于已有的环形般配照明的AIFPM办法老成束缚了照明角度的散布，而所提议的TIDT-NSA则攻破了这一般配照明前提束缚，便可在职意照明角度下知足KK联络中半空间可分化性前提，进而实行了低频相位消息的的确复原。
图4二维和三维光学通报函数的统一框架以及非般配照明下的二维频谱缺失题目。二维通报函数内的频谱份量惟有在般配照前提下才可全面分别；在职意照明角度下，三维频谱散布不停可分别
安设暗示与算法过程
基于上述协商思绪，协商团队建设了TIDT-NSA的显微硬件系统，其安设图、数据获得和重修过程如图5所示。经过将保守明场显微镜的照明光源交换为多个环形LED照明单位，可从不同照明角度晖映待测样本，而且搜罗样本在不同照明角度下的多个强度客栈图象。先将对数运算以后的各个照明角度下的强度图象客栈举行三维傅里叶变幻，得到在不同照明角度下的频谱遮蔽援助域；再贯串KK联络与三维通报函数的分化特征，复原出半空间滤波后所对应相位消息的频谱援助域；结尾行使合成孔径政策将不同照明角度下的埃瓦尔德球壳援助域举行合成，并举行三维通报函数反卷积和非爽束缚正则化等处分，便可实行三维折射率衍射层析重修。
图5TIDT-NSA硬件安设以及做事过程
生物样本三维折射率重修
为了考证TIDT-NSA对具备繁杂布局的三维生物样本举行成像的才力，图6展现了全视场成像规模内奇丽隐杆线虫三维折射率衍射层析的重构成效，收获于系统轴向焦距扫描与多角度照明合成孔径，TIDT-NSA手艺可实行横向分辩率为nm，轴向分辩率为nm的高原料无标识三维层析重构，且可实行在轴向重构深度高出μm的规模内繁杂三维布局及散射情形下的三维折射率层析成像。该线虫三维折射率重构成效证实了TIDT-NSA对布局繁杂的厚生物模范具备较好的三维成像分化力与光学切片才力。
图6稳定线虫的折射三维RI层析重修以及三维衬托成效
另外，协商人员还对动态HeLa细胞的三维折射率举行了重修，图7展现了细胞在成长过程中的形状及折射率散布变动。成像过程中只要幅强度图象，且可实行30秒内一次完全的三维体折射率成像，全面动态视察时长达90分钟以上，且细胞全体描摹与内部细胞器布局细节均能够被明显分辩，如细胞边际处的丝状伪足和细胞内部核膜布局。细胞动态三维衍射层析成效讲解了TIDT-NSA手艺能够在无标识形态下对生物样本进举动态、非侵占、高分辩及高衬度的三维折射率层析成像。
图7HeLa细胞动态衍射层析散布及三维折射率散布衬托成效
04他日瞻望本文推导出了针对二维定量相位与三维衍射层析成像的普适通报函数表白式，并初次将光学通报函数理论与基于Kramers-Kronig的定量相位成像理论统一到了统一个理论框架中。比拟较于Kramers-Kronig联络，本文所归纳归纳的普适通报函数理论从另一个角度越发完全和直觉地揭发了非干预相位复原与衍射层析理论背地的物理图景。更要害的是，该理论不受般配照明前提的束缚，可在职意联络态的照明前提下为定量分化定量相位成像与衍射层析成像系统的分辩率和比较度供应一个雄壮用具。基于此理论框架，提议了基于“三维光强传输”的非干预合成孔径的光学衍射层析办法（TIDT-NSA），TIDT-NSA有机地贯串了基于轴向离焦的光强传输与基于多角度照明合成孔径的思惟，不只将三维衍射层析的成像分辩率拓展至非联络衍射极限，还维持了对繁杂厚样本的高衬度、抗散射、高轴向层析的成像才力。
他日中心须要处分的题目囊括：对多层、屡次散射样本的模子优化、减小量据搜罗量、提高成像速率等方面。另外将TIDT-NSA与三维荧鲜明微成像手艺（如三维布局光照明超分辩荧鲜明微手艺）相贯串24，可为单细胞和亚细胞程度上窥察活细胞内纳米标准的细节翻开新的窗口，希望为单细胞形状学与动力学分化、细胞互相效用、细胞反响、无标识病理诊断等运用周围供应更多的学问与更深的主张。
论文消息：
该协商效果以"Transportofintensitydiffractiontomographywithnon-interferometricsyntheticapertureforthree-dimensionallabel-freemicroscopy"为题在线颁发在Light:ScienceApplications。
来自南京理工大学的博士后李加基为本文的第一做家，左超教给与陈钱熏陶为论文的协同通信做家，南京理工大学为论文的唯独通信单位。
LiJJ.,ZhouN.,SunJS.,etal.Transportofintensitydiffractiontomographywithnon-interferometricsyntheticapertureforthree-dimensionallabel-freemicroscopy.LightSciAppl11,().
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