大家好，今天与大家分享一篇发表在JACS上的文章，文章的题目是ProgrammableCell-FreeTranscriptionalSwitchesforAntibodyDetection。通讯作者是罗马二大化学系的FrancescoRicci教授。

近年来，体外转录翻译过程与可编程响应核酸装置相结合可以方便地应用于多种靶标的检测。其中，合成的核酸链可作为分子支架，通过附加不同的识别元件设计成核酸探针，对不同的靶标进行检测。在该工作中，作者开发了用于检测特定目标抗体的无细胞体外转录系统。该方法基于可编程的抗原缀合的DNA的构象开关，在与靶抗体结合后，可以触发发光的RNA适体的无细胞转录。作者证明无细胞转录开关可以有效地检测血清中的抗体水平。并且，由于传感平台的可编程特性，该方法可以适应于不同抗体的检测。

图1.可编程的抗体响应转录开关。

抗体响应转录开关的策略是基于一对DNA的功能模块，这些模块经过合理设计，可在特定靶抗体存在的情况下触发RNA适体的转录（图1A）。该平台的第一个模块是转录开关，是由两条互补DNA链组成的构象转换发夹DNA（图1A）。这种转录开关由三个主要结构域组成：编码开关RNA输出的双链(ds)部分（红色结构域）、T7RNA聚合酶(RNAP)启动子结构域（蓝色）和编码在发夹的茎环结构。转录开关的输出是发光的RNA适体，该开关的设计在没有特定靶抗体存在的情况下，由于启动子结构域的不完整，RNA适体的转录效率低下。

该平台的第二个模块是由两条抗原缀合的DNA链组成的抗体响应模块。这些链经过合理设计，因此它们的互补部分（黑色，图1A）的杂交可以形成双分子功能复合物（输入），该复合物能够通过链置换反应诱导转录开关的构象变化。这种构象变化会导致形成一个完整的启动子结构域，进而可以被T7-RNAP识别并诱导有效转录（图1A，右）。然而，抗原缀合的DNA链的互补部分被设计成在稀溶液中会形成不稳定的复合物。只有在靶抗体与这两条链二价结合时，才能实现共定位诱导的功能复合物（输入）形成，最终触发与转录开关的反应（图1B）。这些模块可以与市售的无细胞转录试剂盒（包含T7-RNAP、核苷酸和其他成分）一起使用，适体与染料结合后产生荧光信号，进而对目标抗体进行检测（图1B）。

作者设计了一组转录开关，它们都具有17ntT7-RNAP启动子序列和发夹结构，发夹结构为9nt环和6nt茎（图2A）。设计的变体具有隐藏在茎环结构中的可变长度的启动子序列（从1到17nt）（图2B和图2C，三个变体作为示例显示）。作者首先使用了Mango适体，这是一个39ntRNA序列，与噻唑橙(TO-1)衍生物结合，会导致其荧光信号增加。随后，在不存在和存在线性单分子DNA输入链的情况下测试了Mango适体信号（图2D)。作者观察到在不存在输入链、启动子结构域的长度短于12nt的情况下没有荧光信号。通过进一步增加启动子域的长度，可以观察到更高的信号，并在14nt时趋于平稳。相反，在输入链存在的情况下，对于所有具有长于8nt的启动子结构域的开关，都可以观察到有效的转录（图2E,F)。对于较短的启动子结构域，即使在构象转换之后也没有观察到显著的转录，可能是因为形成的启动子中存在缺口会影响有效的T7-RNAP转录。另外，作者发现，在输入链存在的情况下，启动子结构域长度为10nt时，Mango适体的转录表现出最高的增加（图2E，F）。

作者接着对共定位诱导的转录进行了研究。为此，作者在构成抗体响应模块的两条链存在的情况下进行了转录实验。使用的两条DNA链之间的互补部分为6nt（图2G），因为之前已证明该长度对于观察共定位诱导的杂交是最佳的。结果显示，在稀溶液中（30nM），两条链不会导致Mango适体的有效转录，并且仅在饱和浓度下（nM），观察到与单分子输入链相同的信号（图2H）。然后，作者采用二价DNA链充当抗体模拟物(Ab-mimic)，与二价抗体结合方式一样，结合两条分裂输入链的尾部（图2G）。结果表明，即使在稀溶液中(30nM)，该Ab模拟链也能产生与完整单分子输入链相似的荧光信号（图2H、I）。

图3.使用可编程抗体响应转录开关进行抗体检测。

然后，作者对抗体检测的转录开关的原理进行验证。首先，将小半抗原地高辛（Dig）用作识别元件（即抗原），并将其缀合在抗体响应模块链的两端。在不存在和存在抗Dig单克隆抗体的情况下，使用转录Mango开关模块(nM)和两条Dig缀合的DNA链(30nM)进行了转录反应(图3A)。首先，观察到只有在抗Dig抗体(nM)存在的情况下才能实现有效的Mango适体转录，并且输出信号在反应分钟后开始趋于平稳（图3B）。如预期的那样，在抗Dig抗体存在下，当与Mango适体结合后，TO-1染料的发射信号增加（图3C）。值得注意的是，转录开关在10%牛血清中也显示出极好的灵敏度（图3D）。另外，在存在非特异性抗体（nM）或存在Anti-DigFab片段（单价，不能诱导两条抗原缀合的链）时，该平台也表现出高度特异性（图3E）。该传感策略的主要优势之一是它的模块化和多功能性：改变识别元件可以用于检测不同的目标抗体。为了证明这一点，作者采用了与另一种识别元件（即二硝基苯酚，DNP）结合的响应DNA链，并设计了第二个转录开关，将Spinach适体作为报告适体。使用这种新的抗体反应性转录开关，通过测量Anti-DNP抗体(IgG)（图3F），作者发现其灵敏度和特异性与抗Dig抗体观察到的相似（图3G-J）。

图4.用于抗HA抗体检测的模块化转录开关。

对转录抗体响应开关进行原理验证后，作者接下来将其扩展到更多临床相关的抗体。作者设计了一个模块化版本的抗体响应转录开关，可以很容易地适应使用肽作为识别元件。另外，重新设计了两条抗体响应模块链，使其包含一个17nt的尾域，该域可以与肽-PNA链杂交（这降低了合成的难度）。通过这种模块化方法，采用了包含在人流感血凝素（HA蛋白）中的九个残基表位作为识别元件并被抗HA抗体识别（图4A）。这种模块化开关实现了与其非模块化对应物相似的灵敏度和特异性，其灵敏度为纳摩尔级（图4B）。接着，还通过确定四种代表性抗HA浓度水平的加标血清样品的回收率来评估所提出方法的准确性（图4C）。结果表明回收率在77%和%之间具有良好的准确性（图4C）。

综上所述，作者报告了可以被特定靶抗体激活的无细胞转录开关平台。该平台由DNA可编程模块组成，这些模块可以响应目标抗体的存在并触发发光RNA适体的转录。平台的模块化特性使其很容易适用于不同的抗体。并且，该平台具有高灵敏度和出色的特异性。该转录开关还可以有效地检测复杂生物基质（如血清）中的抗体。

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